中四国エイズセンター部内学習用資料：翻訳 No.4

血友病における凝固因子レベルのモニタリング：

活性の測定法と様々な検査法

著者： Jorgan Ingerslev, MD
出典： Addressing Therapeutic Challenges in Haemophilia
翻訳： 広島大学病院　輸血部　藤井輝久

活性の測定法：濃縮因子製剤
　第VIII因子濃縮製剤の表示ラベルは、合衆国とヨーロッパ連合では違う。ラベルに表示してある凝固因子は、合衆国では１段階法による検査法で測定されたものがほとんどであるが、ヨーロッパでは発色色素を用いた方法あるいは２段階法を用いている。
　現在第VIII因子の測定には、様々な方法が用いられている。その測定法の多様性についてRautらは、１段階法と２段階法あるいは発色色素を用いた方法のうちどれが優れているか報告した。12の違う製剤で７つの分野について、国際血栓止血学会（ISTH）の科学小委員会（SSC）によって調査が行われた。リコンビナント製剤については、発色色素を用いた方法から得られた結果は１段階法の結果に比べ、より高値であった。反対に、高純度血漿由来製剤における１段階法の結果は、発色色素を用いた方法の結果よりも高値であった。バッファーや第VIII因子欠損血漿を用いて希釈して高純度製剤を測定した場合には、ほとんど同じ結果が得られた。これら一貫性のない結果のつじつまを合わせるようにISTH/SSCは、高純度またはリコンビナント第VIII因子製剤を第VIII因子欠損血漿で希釈して測定するよう推奨している。また、発色色素を用いた方法はばらつきが少ないことも結論づけた。
輸注後における測定法
　患者が第VIII因子製剤を輸注される場合、我々はin vitroの系で、患者の血液を他の血友病患者の血漿で第VIII因子を希釈して測定し、その値を反映させている。輸注後の検体における第VIII因子活性の反応の記録には、我々はISTH/SSCの推奨に従う必要がある。それによると、重症の第VIII因子血友病血漿で希釈し、次に蛋白を含んだバッファー（例：ウシアルブミン）を用いる。2003年のISTH/SSC（2003年７月）の推奨は、１）１％アルブミンを含んだバッファーを用いて輸注後の第VIII因子活性をモニター；２）Ｂドメイン欠損リコンビナント第VIII製剤の場合には、測定標準として製造者が供給した凝固因子を使用；３）全長リコンビナント第VIII因子製剤に対する凝固因子測定法の標準について、推奨を先送りとする；しかし血漿第VIII因子製剤に用いている標準的な方法での測定は可能　である。
　血友病A患者の治療や出血予防のために第VIII因子の輸注が用いられるが、正確な用量を測定する方法はまだない。さらに、患者によって出血傾向に違いがあるが、出血事象のリスクがより大きい患者を判定できる方法を我々は持ち合わせていない。第VIII因子１単位は、正常な血漿1ｍＬに含まれる第VIII因子に相当することを考えると、高純度凝固因子製剤の単位は血漿の単位を表しているものではない、ことを頭に入れておかなければならない。
　一般に患者は、家庭輸注が彼らの出血性疾患に対する治療の最も重要な進歩であるとともに、生活の質に対して最も影響を与えていると感じている。予防輸注や機能改善を図る手術を行うために濃縮凝固因子製剤を使用することが、治療において大きな進歩となった。しかし依然として、痛みからの解放、止血、出血部位からの血腫の吸収、健康状態を保つこと、機能障害の予防などが治療の目標である。
治療：歴史的観点より
大きな転換期
1970-1975
→　市場に濃縮凝固因子製剤が登場し、その利用が増加
→　家庭療法プログラムが開始
→　凝固因子製剤の予防的使用が広く普及
→　凝固因子製剤を使用した早期のon demand治療と予防的輸注による機能障害の予防
→　理想的な治療オプションとしての選択的手術
1978-1985
→　HIV混入により凝固因子製剤の使用減少
→　1990年以降、濃縮凝固因子製剤の使用は確実に増え続けている
現在の治療反応モデル
　最適な輸注量は臨床的に決められるのであろうか？　また同等量の第VIII因子活性は全ての患者に等しい効果をもたらすのであろうか？
　我々が臨床で採用している測定法は、血漿を基本とした測定法である。１段階の活性化部分トロンビン時間（APTT）法は、内在性のトロンビン合成を必要とする。記録される凝固時間は、反応中のトロンビン合成から患者の血漿中に存在する凝固因子の相互作用までである。酵素発色法などの２段階法は、広く普及していない。記録される第VIII因子分子の最大活性を誘発するために、反応物にはトロンビンが必要である。これら両方法とも凝固の初期あるいは、かなり早い段階を反映しているものである。Henkerらは、全体の凝固過程や内在性のトロンビン活性を評価することを提唱した。

《図1》トロンビン合成：トロンビン産生を経時的に測定
　こういった研究者が用いた酵素を使った方法は、フィブリン除去血漿や濃厚血小板血漿で起こるトロンビン合成を発色色素や蛍光色素で見る方法である。トロンビン活性が出現し消失することを示す曲線を図１に示す。この検体では凝固開始後６分で見られているが、正常血漿で起こる凝固のピークを数分の時間経過と共にグラフで表した。さらに、血塊の弾性に依存する改良トロンボエラストグラフのような他の方法が、フィブリン合成率やたぶんトロンビン合成を測定するのに有用であろうとされてきた。

《図2》患者血液中の残存第VIII因子活性　APTT/第VIII因子活性　１段階法
表現型の発現
　重症血友病ではAPTTが延長するが、第VIII因子活性が１％未満の場合APTTの値は様々である（図２）。第VIII因子濃度とAPTTとの間の相関はかなり弱い。

《図3》患者血液中の残存第VIII因子活性　APTT/第VIII因子活性　染色色素を用いた測定法

《図4》１段階法/２段階法で一貫性のない軽症血友病Aの変異体
　ミスセンス変異のある軽症血友病の46家系を比較すると、発色色素を用いた測定法と比べ１段階法ではオーバーシュートが見られる（図５；１段階法による測定値から発色色素を用いた方法による測定値を引いた値をグラフにプロット）。こういった例は、患者間での遺伝子の多様性を示唆し現在使用している測定法に影響を与えるもので、臨床的測定法の限界を知らしめる現実の問題である。

《図5》軽症血友病の46家系　結果の違い（1段階法による第VIII因子

活性値から発色色素を用いた測定法による第VIII因子活性値を引く）
第VIII因子の回収率
　ある量の第VIII因子の輸注後の活性の上昇を、回収率としている。その反応は、輸注したIU/kg当たりのIU/dLとして測定される。第VIII因子の上昇期待値は、kg当たり１単位で２IU/dLである。しかし、回収率も上昇期待値として表現することができる。この反応の測定は、出血や手術の際に必要な使用量を計算するために有用である。
　回収率は第VIII因子の輸注後の活性の上昇である。それは、上昇期待値のパーセントとして表現される。

《図6》回収率のデータ　第VIII因子の回収率
　患者がある凝固因子製剤から他に変更した後に、上昇期待値のパーセント表示で第VIII因子の回収率を比較したのが図６である。平均回収率が約80%のpd-1のグループのデータは、オーバーに表示してあったと思われる血漿由来製剤からのものである。次の３つのグループ（血漿由来とリコンビナント製剤）は、全て比較的高い値となった。

《図7》回収率のデータ　リコンビナント第VIII因子製剤の回収率（BDD rFVIII血漿FVIII標準を用いた）
　Bドメイン欠損第VIII因子を用いた時、使用後の第VIII因子活性値に測定法による不一致が存在する。この場合、測定システムに似たような原理のものを採用することが、他の凝固因子製剤を使用することよりも大切である。これが、輸注後の第VIII因子レベルを測定する際に凝固因子標準を用いることとするISTH/SSCの推奨の理由である。APTTの試薬によっては、１段階法で測定した第VIII因子活性は２段階法（発色色素を用いた方法）に比べ約20-40％低値となる。推奨された凝固因子標準を用いて、１段階法とクロマチン法による測定結果はこれから比較されていくだろう。血漿標準の凝固因子標準を用いる代わりに、発色色素を用いた方法が採用されるかも知れない。
臨床応用：現在のジレンマ
◆　なぜ重症血友病患者の中には、他の患者より出血が少ないものがいるのか？
◆　臨床的な表現型の多様性について、ルーチンの検査法では検出できない（第VIII因子活性、１段階または２段階法）
◆　同様の効果を得るためになぜ、他の患者より多くの凝固因子を必要とする患者がいるのか？
◆　血友病の治療に用いられる製剤の純度や製造技術が大きく違う
◆　最適な治療結果のための必要量を予測できる検査法が存在するか？

《図8》

従来の凝固検査法は凝固形成の開始の情報を返してくれる

凝固形成の開始後、血塊の大部分が持続的に形作られる
　二つの代替検査が利用できる。その検査法とは、前述したフィブリン欠損血漿における凝固過程のトロンビン合成を酵素で見るHenkerが改良した方法と、数学動態学的解析を用いて直接または間接にトロンビン合成を見る（例：分子マーカーのTAT、フィブリノペプチド）Kenneth Mannが採用した方法である。
　前述したように、改良トロンボエラストグラフは新しい代替法である。トロンボエラストグラフは、全体の凝固過程を全血での血塊弾性でみるものである。弾性はトロンビン合成の過程であるフィブリン重合の機能を示している。

《図9》凝固の経時的なプロファイル　全血での凝固形成の速度プロファイル
解析の方法論
roTEGトロンボエラストグラフ凝固解析システム
全てのパラメーターは、速度を測定することにより凝固動態を評価するソフトプログラムで計算した
解析の方法：
300 ulのクエン酸血を検体として、あらかじめ全てのプラスチック容器を37度に暖めておきそこに30分静置
最終的に１：17,000に希釈（約0.35 pM）した組織因子（Innovin）20 ulを添加
200 mMのCaCl 20 ul添加して凝固を開始して、roTEG解析

《図10》血小板数の影響

《図11》血友病患者のパターン

重症と中等症血友病患者における全血凝固形成の経時的なプロファイル

　トロンボエラストグラフの技術を用いると、血友病A患者において重症と中等症の全血での凝固形成の比較が可能になる。重症血友病では（第VIII因子活性が１％未満）、凝固形成において確かな違いが明らかになる。凝固形成が非常に遅く曲線が平坦に近くなって、ほとんど凝固形成が起きない場合がある。またこのプロファイルに関する明らかな病理はなく、中には正常パターンを示すものもいる。より高濃度の第VIII因子活性を持つ中等症血友病患者でも、大きな多様性があることが明らかになったが、少なくともプロファイルの一つに、重症血友病患者から得られたものとほぼ同様のものがあった。

《図12》患者#1におけるリコンビナント第VIII因子製剤の反応モデル

生体外で様々な量のリコンビナント第VIII因子製剤を添加

《図13》患者#2におけるリコンビナント第VIII因子製剤の反応モデル

重症血友病患者の全血における低用量のリコンビナント第VIII因子製剤の反応

《図14》

《図15》表現型の多様性
　重症血友病A患者には、二つの特徴的なグループがあることがわかった。それぞれのグループの２名の患者について図１５に示す。２種類の患者データのプロファイルは似ているように見えるが、根本的には遺伝子型の違いと思われる二つの違った表現型であることに注目すべし。

《図16》イントロン22逆位の２人の患者
　重症血友病患者間でさえも表現型の違いが存在する
　これらの予備的な結果を立証する研究が将来必要となるであろう。凝固の安定性を見る検査や組織学的検査結果より、十分なホメオスターシスに最低限必要な要因があることが示唆されたが、さらなる研究が必要である。
　重症血友病A患者それぞれ、その特異的な全血凝固検査の表現型に従って、治療を個別化する必要があるように思われる。
脚注
「図３」図３は、図２と同じ患者の検体で、APTTと第VIII因子濃度を発色色素を用いた測定法で測定しプロットしたものである。図２のグラフと比較すると、患者のデータの多くはX軸を左にシフトしている。この測定法による値の不一致は、患者の第VIII因子の遺伝子異常に関係している。A1, A2, A3ドメインの交差部位に変異が起きると、トロンビンによるお互いのドメインの未熟な解離が起こる原因となる（図４）。
「図７」Bドメイン欠損リコンビナント第VIII因子製剤を使用すると、１段階法と２段階法を用いた場合で得られる回収率が違う。それぞれの患者で１段階法ではかなり低い値となる。
「図８」凝固形成過程を調べる最も頻繁に用いられる２つの検査結果（PT、APTT）は、凝固過程のとても早い時期のものを反映している（図８）。我々は全体の凝固過程を測定する代替の方法も利用できる。
「図９」凝固の進行は二つのパラメーターで決まる：グラフ中の振幅を表す最大速度とtmax速度と呼ばれる振幅までにかかる時間である。この検査システムは、希釈しない全血を用いる（方法論を参照）。
「図１０」これらの結果には、血小板数の重要性が示されている。血漿の血小板濃度が高くなるほど、高い振幅が得られた。
「図１２」図１２のグラフのカーブの値は、元来第VIII因子活性が低いある重症患者において、その血液にリコンビナント第VIII因子を添加した時のデータ・プロファイルである。わずか１単位（１％あるいは0.01 U/mL）添加した場合でも明らかに反応していることが分かる。第VIII因子を正常に補正してもその値は50％から100％の間にばらつきがみられたことは、予想しなかった所見である。
「図１３」２種類の違うリコンビナント第VIII因子製剤を輸注された患者の二つのデータ・プロファイルである。1/2％(0.005 U/mL)といったごく少量の第VIII因子でも凝固に対して劇的な影響を及ぼす。５％（0.05 U/mL）の凝固因子で補正した際の反応に注目すべし。これらの製剤は、同一患者には同一の効果を示す。
「図１４」図１３とは別の患者において２種類の違うリコンビナント製剤を輸注した第２例目も同様の結果を示した。この例では、ごく少量の第VIII因子の輸注でも有意な反応性を示したが、同様に正常の100％に用量を増やしていくと反応性も高くなった。
「図１６」図１６は共にイントロン２２の逆位と診断された同一家系の２人のデータ・プロファイルである。一方（紫色で示したプロファイル）は血友病により重度の障害を持っている。彼は関節障害を改善するためにいくつかの部位の手術を受けていた。反対に、彼の叔父（黒色で示したプロファイル）は、股関節に若干の血友病性関節症があるだけであった。共にイントロン２２の逆位にもかかわらず、その臨床像は全く違っている。重症血友病患者間でも遺伝子型とは関係ない表現型の違いが存在する。
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